SNP主要指在基因组水平上,由于单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性。其在生物基因组中分布广泛、数目多且相对稳定,是物种中不同个体表型变异的主要遗传来源。而且SNP标记技术易于自动化、高通量的检测分析,所以使SNP成为继第一代分子标记技术RFLP与第二代分子标记技术STR多态标记后的第三代分子标记技术。由生物基因组中SNP的密度是最高的,是构建生物高通量基因分型最适合的标记,但是由于SNP是单核苷酸变异产生的多态性,所以不能使用常规的PCR技术与凝胶电泳技术来区分其多态性。而使用测序技术来分析SNP位点,这样虽然标记密度高,但是成本也相对很高,而且很耗时。所以,竞争性等位基因特异PCR(Kompetitive Allele Specific PCR ,KASP)因其经济灵活的特点,作为国际上主流SNP检测方法之一,替代传统的高通量测序,在SNP分型研究中发挥重要作用。
1、含有SNP的单倍型基因-1和单倍型基因-2作为模板;针对等位基因SNP位点设计的两个正向引物和一个通用反向引物;每条正向引物尾部有特异性序列,可与荧光标记结合。
3、随着PCR循环数增加,扩增子数量呈指数增长,荧光探针更多地退火到新合成的互补链上,发出荧光。不同颜色荧光即反映不同SNP类型,使用酶标仪对实验结果进行检测就能够达到我们的最终实验目的。
KASP检测基因分型在农业领域中,可以进行性状基因的精细定位、分子辅助育种、种子资源鉴定、样本群体分析等;在医学领域中,则主要是疾病的分子遗传机制研究、疾病基因定位、药物敏感或疾病易感性位点筛选等。华中农业大学余四斌教授及其团队基于KASP技术开发了用于水稻特殊营养物质、水稻产量等基因分型引物,并获得该引物应用专利(专利号:201710751904.1,专利号:201710297282.X)。
1、样品数量:样本数量越大,成本越低;
2、样品浓度: 100ng/ul-1000ng/ul
3、样品用量: 至少200ul(根据检测标记数量确定)
4、样品纯度: 无明显杂质、大分子及颜色,OD260/230 大于1
红色荧光代表单倍型1(allele-1),蓝色荧光代表单倍型2(allele-2),绿色荧光代表杂合型(heterozygous)
1. KassaSemagn et al. (2013) Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specifi c PCR (KaSp): overview of the technology and its application in crop improvement. Molecular Breeding.