转基因分子特征的研究方法
分子鉴定是转基因安全性评价中重要的一步。除了在获得转化事件初期对转基因整合情况进行检测,后续还要对转基因进行详细的基因水平、分子水平及生化水平分析,包括对转基因事件染色体倍性、转基因整合位点、转基因整合位点的结构、转基因的拷贝数、载体骨架整合、转基因表达(RNA水平和蛋白质水平)等。
1、 染色体倍性评价(Determination of ploidy)
染色体倍性评价是评价转基因事件的重要内容。在转基因的T0代和T1代对染色体倍性进行鉴定是筛选转化植株的第一步。转基因事件应具有与受体植株相同的染色体倍性,可以通过DNA流式细胞仪对转基因事件的染色体倍性进行快速鉴定。
2、 转基因整合位点分析
转基因的稳定性依赖于转基因在基因组上的整合位点。由于目前实现转基因在基因组特定位点整合比较困难,转基因的整合位点通常是未知的。研究T-DNA的整合及整合位点序列信息对避免转基因丢失具有重要意义。转基因的侧翼序列信息是转基因作物风险评估的重要内容。
物力图谱和遗传图谱可以展示转基因整合的图景。细胞遗传学技术(Cytogenetic techniques)例如荧光原位杂交(FISH)可以用于研究转基因在染色体上的整合。还可以通过反向PCR(Inverse PCR)、TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)、随机引物PCR(random primed PCR)及接头介导的PCR(adaptor ligation-mediated PCR)研究T-DNA在染色体上的整合位点。通过鉴定转基因整合位点基因组侧翼序列,可以对转基因是否破坏功能及调控基因、是否产生新的阅读框架(ORFs)从而导致新的嵌合蛋白产生等内容进行评价。侧翼序列信息可以进一步用于转基因纯合植株的鉴定。
转基因在植物基因组中的整合不可避免的破会植物内源DNA的序列,并且可能伴随着基因的修饰或者沉默、突变及多效性影响。为准确判断转基因可能引起的插入突变需要对转基因插入位点处转基因序列、冗余DNA序列及侧翼植物基因组序列等内容进行全面的研究,需要比较插入位点序列与非转基因受体品种该位点处的序列。
3、 转基因位点的结构和遗传
转基因位点的结构影响转基因表达水平和稳定性。为分析转基因位点的结构需要对转基因及侧翼序列进行全面的测序。需要对转基因片段的内部是否存在直接重复、反向重复、串联重复、富含AT序列、卫星序列、回文序列、茎环结构等内容进行分析。
在分子水平对转基因位点进行分析并且分析转基因编码的表型在后代中的分离可以用于研究转基因的遗传。通过比较初代转基因事件和后代转基因事件转基因的杂交带型可以分析转基因在后代中的遗传,通过回交可以分析转基因通过有性生殖传递的稳定性,并且可以分析转基因的遗传是否符合孟德尔遗传定律。